باکتری گرم مثبت

باسیلوس thuringiensisis یک باکتری گرم مثبت است که ماده حشره کش اگزوتوکسینδ به نام پروتئین های کریستال (Cry) را تولید می کند.

سرووار tolworthi باسیلوس thuringiensisis  یک سرووار معرف می باشد که برای بیش از 50 سال مطالعه شده است.

با این حال، تنها توالی ژنوم انتخابی سرووار tolworthi  نژاد Na205-3 قابل دسترس می باشد

(1). در اینجا، ما یک توالی ژنوم کامل از باسیلوس thuringiensisis  نژاد سرووار tolworthi  را از موسسه استاندارد پاستور، که در دانشگاه ساگا از 20 سال قبل معرفی شد گزارش نمودیم.
تجزیه و تحلیل DNA  تصفیه شده با سیستم PacBio RS II   عملکردی در حدود 103505 قرائت با میانگین طول 5.5 kb (پوشش ژنومی 70 برابری) را نشان داد.

قرائت ها با  Sprai نسخه 0.9.9.2 تصحیح شده است(http://zombie.cb.ku-tokyo.ac.jp/sprai/)  و مونتاژ آن با اسمبلر Celera  نسخه 8.3rc1   (2)انجام گرفته است.

از آنجا که عمق پوشش قرائت  PacBio  (حدود 25 برابر) در منطقه در نزدیکی انتهای تکرار کروموزومی کم بود ، جمع آوری این منطقه تنها با قرائت PacBio  مشکل بود .

بنابراین، ما مجموعه ترکیبی با استفاده از PacBio  و ILLUMINA ساختیم که (7 میلیارد پوشش نوکلئوتیدی ژنوم  بیشتر از 1،000 بار) با نسخه SPAdes  3.5.0 قرائت انجام می دهد.

contig های به دست آمده از هر دو روش به طور دستی جمع شده  و توالی مونتاژ با Quiver (https://github.com/PacificBiosciences/GenomicConsensus/blob/master/doc/HowToQuiver.rs

 با استفاده از PacBio قرائت شد .

از آنجا که اکثر خطاهای توالی که در PacBio خوانده شده است درج/حذف (indels) شد (4) و نقشه برداری از قرائت گر ILLUMINA با توالی مونتاژ، وجود تغییرات در ایندل به ویژه در منطقه­ای در نزدیکی انتهای تکرار کروموزومی نشان می داد، ما این تغییرات را بر اساس نتایج نقشه کشی تصحیح کردیم.
ژنوم شامل 5896839 bp  کروموزوم مدور ، 14827 جفت پلاسمید خطی pKK6، و هفت پلاسمیدها مدور  pKK1 (437451 BP)، pKK2 (293217 BP)، pKK3 (130548 BP)، pKK4 (54355 BP)، pKK5 ( 23773 BP) ، pKK7 (11769) ، و pKK8 (7812)  می باشد .

برنامه MiGAP (http://www.migap.org/index.php/en)  7044 توالی کدگذاری شده،  112 tRNA ها و 36 rRNA  را پیش بینی  نموده است.

بیشتر کروموزوم های سنتزی حفظ شده در حال حاضر در نژادهای مختلف باسیلوس thuringiensisis (یعنی نژاد کینانسیس سرووار CT-43  (5) عرضه شده است.

پلاسمید خطیpKK6

پلاسمید خطی pKK6 حاوی تکرار معکوس انتهایی در هر دو انتها می باشد و ویژگی های خورندگی دارد و توسط ابزار جستجوی خورندگی PHAST  پیش بینی می شود (6).

از آنجا که عمق پوشش قرائت  ILLUMINA  در هر دو انتها کم می باشد( تقریبا10 برابر)، ما این توالی با استفاده از روش سانگر تائید کردیم.

پلاسمید حاوی ژن pKK2 شامل ژنهای مشابه پروتئینهای حشره کش، VIP2، Cry2Aa، Cry1Ia و Cry1Ea  می باشد هر چند که پروتئین Cry1Ia ممکن است ناقص باشد.

پلاسمیدهای شبیه به  pKK2 در چند نژاد  باسیلوس thuringiensisis حضور دارند:  pBMB299 در سرووار kurstaki  نژاد HD-1 (http://bacteria.ensembl.org/bacillus_thuringiensis_serovar_kurstaki_str_hd_1_gca_000717535_1/Info/Index/;82% query coverage),

pBMB293  در سرووار  kurstakiنژاد YBT- 1520 http://bacteria.ensembl.org/bacillus_thuringiensis_serovar_kurstaki_str_ybt_1520_gca_000688795_1/Info/Index/;       82% query coverage)

pIS56-285 در زیر گونه نژاد thuringiensis IS5056 (با 81 درصد پوشش جستجو) (7)، pCT281 در نژاد کینانسیس سرووار CT-43(با 81 درصد پوشش جستجو) (5)، pBMB267، در نژاد galleriae سرووار (با 66 درصد پوشش جستجو)(8). می باشد.

جستجوی BLAST نشان می دهد که  باسیلوس thuringiensisis  سرووار tolworthi نژاد Na205-3  (1) حاوی توالی که تا حدی شبیه به پلاسمید pKK2 بوده است.

شماره های قابلیت دسترسی به توالی نوکلئوتید.

توالی کامل ژنوم باسیلوس thuringiensisis  نژاد  سرووار  tolworthi در موسسه استاندارد پاستور در بانک ژن DDBJ/EMBL به شماره AP014864  (کروموزوم) و AP014865  و AP014872  (پلاسمید) نگهداری می شود.