bacillus

باکتری باسیلوس

باکتری باسیلوس thuringiensis   به طور گسترده ای به عنوان آفت کش زیستی که مواد فعال حشره کش را در طول چرخه زندگی خود تولید می کند استفاده شده است.

جداسازی و خالص سازی  مواد فعال حشره کش به دلیل نیمه عمر کوتاه این مواد مشکل بوده است.
از سوی دیگر، ترکیبات را می توان در زمان های مختلف در طول توسعه اش، سنتز نمود، به طوری که نمونه در مراحل مختلف باید بررسی شوند، پیچیدگی های بعدی در آنالیز خواهند داشت.

رویکرد دوگانه ژنومی و پروتئوم توانایی ما را برای شناسایی این مواد، بویژه استفاده از روش پروتئوم مبتنی بر طیف سنجی جرمی را بالا می برد.

آنالیز مقایسه ای برای نه همه­ی داده های ژنومی و پروتئوم نشان داد که همه محصولات حاصل از ژنوم به طور مشروح می تواند در میان داده های پروتئوم شناخته شود.

به عنوان مثال، نتایج تفسیر ژنوم نشان داد که 39 توالی کدنویسی در کل ژنوم مربوط به بیماریزایی حشرات، از جمله پنج ژن Cry است.

با این حال، Cry2Ab، Cry1Ia، سیتوتوکسین  K، باکتریوسین، اگزوانزیم C3 و آلوئولیزین نمی تواند در داده ها به دست آمده از پروتئوم شناسایی شوند.

پروتئین های مرتبط با تولید هاگ نیز برای آنالیز مقایسه شد، نتایج نشان داد که پروتئین مرتبط با تولید هاگ می تواند با طیف سنجی جرمی شناسایی شود.

این آنالیز نشان داد SpoA~P, SigF, SigE(+), SigK(+) and SigG(+)، همه مشخص شده اند که نقش مهمی در روند شبکه نظارتی تشکیل اسپور، بازی می کند همچنین در داده پروتئوم نمایش داده شد.

از طریق مقایسه دو مجموعه داده، ممکن است به این مساله پی ببریم که برخی از ژن ها خاموش بودند یا در سطوح خیلی پایین بیان شده است.

به عنوان مثال، مشخص شده که  cry2Ab فاقد پروموتر کارکردی است در حالیکه  cry1Ia ممکن به دلیل حضور ترانسپوزون ها نمی توان بیان شوند.

با استفاده از این مطالعه مقایسه ای یک پایگاه داده نسبتا کامل می تواند ساخته شود و مورد استفاده برای تبدیل مواد ارثی شود در نتیجه باعث بیان بالایی از پروتئینهای سمی می شود.

مبنای نظری برای ساخت باکتریهای مهندسی بسیار خطرناک و برای ترویج استفاده از پروتوژنومیک در علوم حیات تدارک دیده شده است.

مقدمه بر باکتری باسیلوس

باکتری باسیلوس thuringiensis  به طور وسیع به عنوان آفت کش زیستی بکار رفته که مواد فعال حشره کشی مختلفی درطول سیکل زندگی خود تولید می کند.

همانطور که در اینجا نوشته شده یک دوجین مولفه های زیست فعال مختلف  باسیلوس thuringiensis   مشخص شده است .

هنگامی که برخی از سموم عالی نژاد  باسیلوس thuringiensis   ایزوله می شود و به وسیله روشهای مرسوم  مانند، کروماتوگرافی کشش یا الکتروفورز با تمرکز بر ایزوالکتریک مشخص شد محققان اغلب موفق به دست آوردن یک درک جامع از مواد فعال حشره کش شده اند.

جداسازی و خالص سازی های متعدد مواد فعال حشره کش به دلیل نیمه عمر  نسبتا کوتاه این مواد مشکل است.

آنچه در روش های مرسوم مهم است  تنها در میان بسیاری از ابزار پژوهشی، و همچنین نقص در آنالیز به قدر کافی ، جامع و دقیق باسیلوس thuringiensis   با مواد فعال با فعالیت حشره کشی می باشد. و مطالعات نشان داد که استفاده ژنومیک و پروتئومیکس به ترتیب، درک ما برای این مواد بالا می برد.

در سال 2001، اولین طرح ژنوم انسان با موفقیت توسط محققان منتشر شد و این مطالعه ، تحقیق بیشتر در مورد مواد فعال حشره کش در سطح ژنومی را برانگیخت .

نژاد CT-43 برای تعیین اولین توالی کامل کلی ژنوم ژن پروتئین کریستال حشره کش (cRY) بکار رفته و یک ژنوم تمام قد 6.15 MB به دست آمد.
این نژاد حداقل شش نوع پروتئین سمی تولید می کند(8).  و در حال حاضر، 15 عدد باسیلوس thuringiensis   توالی کلی ژنوم را کامل کرده، 15 باسیلوس thuringiensis   مونتاژ کروموزوم را تکمیل کرده اند .

علاوه بر این، 11 باسیلوس thuringiensis   در حال پیرایش هستند .

باسیلوس

ژنومهای باکتری باسیلوس

برخی از ژنومهای باسیلوس thuringiensis   در یک گستره اندازه 5.31 تا 6.77 Mb (شامل یک یا چند پلاسمید مدور)  می باشد که با انتشار توالی ژنومی  باسیلوس thuringiensis   ، محتویات گوانین-سیتوزین (GC) این چنین ژنوم بین 34.5٪ و 35.6٪ است (9-11). باسیلوس thuringiensis توالی دار قادر به تشخیص سریع ژن است که پروتئین ها با فعالیت های حشره کشی بالقوه در سطح ژنوم را کدگذاری می کند.

توالی ژنوم منتشر شده از باسیلوس thuringiensis  و سرووار HD-789  نژاد اسرائیلی شامل هفت ژن سمی Cry، سه ژن سمی  Cytو یک ژن هماگلوتینین (12( می باشد. توالی ژنوم باسیلوس thuringiensis   زیرگونه نژاد  thuringiensis  IS5056  شامل 9 ژن سمی Cry (13) می باشد.
پژوهش روی ژنوم باسیلوس thuringiensis   با تشخیص ژن های بیماری زای مهم و مرتبط با فاکتورهای تنظیم کننده شتاب گرفت. با این حال، اطلاعات در مورد پروتئین هایی که از ژنوم به دست آمد محدود است.

اصلاح پروتئین، فعل و انفعالات پروتئین-پروتئین و تعامل پروتئین با دیگر اجزای مولکولی به طور مستقیم از توالی ژنوم مشخص می شود.

بنابراین، برای درک عمیق تر از کارکرد و بیان ژن های بیماری زا، پروتئین باید در سطح پویایی و شبکه به طور کلی مطالعه شود، در مجموع به عنوان تحقیقات پروتئوم شناخته شده است.

وو دی  و همکاران نژاد پروتئومیکس YBT-1520 باسیلوس thuringiensis   را تحت شرایط درجه حرارت بالا مورد مطالعه و پروتئین بیان شده شامل هاگ و پروتئین Cry حشره کش هم شامل این مطالعه بود به این نتیجه رسیدند که بیان چنین پروتئین هایی پس از تیمار در 42 ° C  کاهش می یابد (14).  هوانگ و همکاران بیان پروتئین های دیگر در باسیلوس thuringiensis   را از طریق مطالعه پروتئومیکس در مراحل مختلف رشد با استفاده از طیف سنجی جرمی/-کروماتوگرافی مایع / طیف سنجی جرمی (LC-MS / MS) مطالعه و آنالیز مقدماتی برای پروتئین های مرتبط (15) انجام شده است.

به طور رایج، LC  روش پروتئومی برای آنالیز ترکیبات پیچیده پروتئین مقدم بر انالیز  MS می باشد (16، 17). این روش نشانگر توانایی قوی برای شناسایی، اصلاح، کمیت، و ترجمه و بومی سازی پروتئین می باشد(18، 19). بنابراین، روش پروتئوم مبتنی بر طیف سنجی جرمی می تواند به طور گسترده ای در تحقیقات مواد فعال حشره کش اعمال می شود.

روشهای ژنومیکس و پروتئومیکس

بر اساس داده های ذکر شده در بالا، روشهای ژنومیکس و پروتئومیکس را می توان در مطالعه پروتئین با فعالیت حشره کشی و با ویژگی های مختلف باسیلوس thuringiensis  بکار برد.

با این حال، فقدان اطلاعات در مورد ترکیب ژنومیکس و پروتئومیکس در مطالعه پروتئین های باکتری باسیلوس thuringiensis   با فعالیت حشره کشی بکار برده شد. محمد A.I و همکاران مطالعات ژنومی و پروتئوم در روی این پروتئین ها انجام داد و یک روش تحقیقی جدید که در پروتئوژنومیک می تواند در مطالعات مختلف استفاده می شود توسعه داده اند(20-23). بنابراین، این روش شناسی نه تنها در کشف ژن پروتئین حشره کش و عوامل نظارتی، بلکه در آنالیز بیان ژن بیماری زایی استفاده می شود.
آزمایشگاه ما در پژوهش درمورد آفت کش های باسیلوس thuringiensis   شرکت کرده است.  در مطالعه حاضر، ما توالی کلی ژنوم را برای آنالیز نژاد سمی 4.0718   باسیلوس thuringiensis   بررسی کردیم و ژن بیماری زایی مربوط به فعالیت آفت کشی تحقیق شد. آنالیز طیف سنجی جرمی  پروتئوم  باسیلوس thuringiensis   برای دوره های مختلف برای به دست آوردن بیان افتراقی پروتئین انجام شد. اولین چیزی که ما از  داده ژنومی باسیلوس thuringiensis   بدست آوردیم ژن شدت سمیت می باشد. و سپس داده های پروتئوم بر اساس MSبا داده های تفسیری ژنوم مقایسه شده، تشکیل اسپور و تنظیم آن تجزیه شده ، شبکه تعامل پروتئین حشره کش Cry پیش بینی شده و نتایج تفسیر ژنوم تأیید شده است. نتایج تحقیقات از کل توالی ژنوم و آنالیز MS  پروتئوم می تواند مبنای نظری برای ساخت باکتری های بسیار خطرناک، مهندسی ژنتیک شده و برای استفاده از پروتئوژنومیک در علوم زندگی باشد.

مواد و روش ها

نژادهای باکتریایی و شرایط رشد آن

ارگانیسم مورد استفاده در این مطالعه باسیلوسthuringiensis   4.0718 (CCTCC No.M200016) بود. آن در یک ترکیب آبکی LB (با pH 7.6) متشکل از پلی پتون (1%)، عصاره مخمر (0.5٪)، نمک طعام (1٪) و در آب مقطر با دمای 30 درجه با تکان 200 دور در دقیقه برای کشت یک شبانه روز به عنوان محیط کشت ، رشد داده شد. یک محیط پیش کشت 400 UL در 20 میلی لیتر محیط LB با od=1.0 در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 2.5-3 ساعت تلقیح شد.

استخراج و آزمایش DNA

DNA  کلی ژنوم از باسیلوس thuringiensis نژاد 4.0718 با کیت DNA باکتریایی (امگو، آمریکا) جداسازی شد و به دستورکار در مورد فرایند دقیق استخراج  دقت کنید.  DNA با استفاده از یک نانو دراپ 2000 (علوم گرما) و همگن از طریق الکتروفورز ژل آگارز (1 درصد آگارز) مورد بررسی قرار گرفت. نمونه ها برای توالی گیری به علوم زیستی Nextomics ، وو هان فرستاده شدند. تعیین توالی توسط ILLUMINA Hiseq 2000  انجام شد.  Nextomics ، غلظت مخزن آزمایش شده را بوسیله  qPCR که  246.5 nmol/L  آماده و اندازه قطعه توسط کمپانی Agilent 2100 Bioanalyzer  تجزیه شده 609Bp بود.

تولید و تکمیل ژنوم

ابزار ردیفی مجددا صابون زده برای داده های بی نقص استفاده شد. فرآیندهای تولید (مونتاژ) شامل مراحل زیر است (1) داربست با NCBI مخزن NR/NT برای به دست آوردن اندازه و موقعیت هر یک از داربست و تعیین این که کدام داربست توالی کروموزوم است مقایسه شد ، آن توالی پلاسمید بود. (2) نزدیک ترین گونه باکتری باسیلوس thuringiensis   kurstaki  سرووار HD73 به عنوان ژنوم مرجع انتخاب شده (16 rDNAشباهت 100٪ دارند، داده ها نشان داده نشده) و ژنوم کروموزومی دانلود شد (3) به 199 داربست درون رابط های مختلف جستجوشده با استفاده از کیت تفسیر ژن 3.0، بنگرید و از آنجا که بخشی از توالی در هر دو انتهای هر داربست ممکن است با دیگر داربست همسان باشد، به دنبال دیگر داربست برای اینکه قادر به همپوشانی باشند (4) استفاده از نرم افزار مونتاژ DNAMAN برای بخش همپوشان داربست و مونتاژ درون یک داربست طولانی تر (5) پرایمر  PCR برای تعمیر شکاف بین داربست و تکمیل مونتاژ داربست طراحی شود.

نتایج
تعیین توالی کل ژنوم، مونتاژ، و آنالیز عملکرد

ما دستگاه توالی را پس از ساخت مخزن بکار بردیم. تعیین مجموع توالی ژنوم با استفاده از استراتژی شاتگان همراه با سیستم های تعیین توالی بالا  (Hiseq 2000) انجام شد، و این چنین روشی 23548110 قرائت با کیفیت بالا با طول متوسط ​​99 تولید نمود. همه قرائت های زوج با استفاده از SOAPdenovo (نسخه 2.04) جمع شده که منجر به تولید 639 contig (هر contig 100bp دارد) شد. نتایج حاصل از داده های با کیفیت بالا جمع شده به شرح زیر است: اندازه ژنوم باکتریایی 6.3 MB بود؛  N50 در اندازه 93 kb بود. حداکثر طول 222.9 KB بود. محتوای GC 34.7٪ بود. و بیش از 2 KB  contigs 187Bp بدست آمد.
پس از تولید اولیه، در نتیجه تعداد 199 داربست بدست آمد. باسیلوس thuringiensis   نژاد سرووار kurstaki  HD73  به عنوان یک مرجع برای آنالیز 199 داربست و برای این داربست با استفاده از کیت ساختاری ژن 3.0 و نرم افزار DNAMAN انتخاب شده است. در مجموع 15 شکاف در روند مونتاژ شده پیدا شد. کوک به وسیله پرایمر و تقویت PCR با مسیر طولانی انجام گرفت. اندازه ژنوم مونتاژ کروموزوم،  5641982 Bp می باشد. هفت پلاسمیدها در باسیلوس thuringiensis    4.0718 تشخیص داده شد، و یک درجه شباهت بالایی  میان pHT7، pHT11، pHT8-1، pHT8-2، pHT73، pHT77 و pCT281 جدول (1) وجود داشت.  pCT281 با مونتاژ عمل نکرد.  نتایج مونتاژ نشان داد اطلاعات دیگر، از جمله ncRNA  (جدول 2) و یک توالی تکراری نشان داده شده است.
6797 توالی کددار (CDS ها) توسط نرم افزار Prodigal.v2_60 جستجو شده است. مجموع CDS 5243835  BPبود که برای 83٪ از ژنومها بود. آنالیز داده ها نشان داد که باسیلوس thuringiensis   4.0718 تا از مجموع 6،747 CDS ها با پیام های کد گذاری در بر می گیرد؛ 72.93% از CDS ها با کارکرد کددهی پروتئین در ارتباط بودند، در حالی که 27.07٪ CDS وظایف ناشناخته داشتند. نرم افزار BASYs و RAST در زیر سیستم و مجموعه ای از مقوله های کارکردی گروه ارتولوگ (COG) برای پروتئینهایی که از ژنوم توالی شده به طور کامل به دست آمد اعمال می شود. این CDS ها با استفاده از نرم افزار فوق برای تعیین وظایف خاص هر CDS در روند متابولیک طبقه بندی شدند.

مطلب مفید

باسیلوس thuringiensisis

لطفا رای دهید
[Total: 0 Average: 0]

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *